農(nóng)用微生物菌劑（GB 20287-2006）

前 言
本標(biāo)準(zhǔn)的5.1、5.3和第8章條文為強(qiáng)制性條款，其余為推薦性條款。
本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄C和附錄D為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。
　
農(nóng)用微生物菌劑
1　范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了農(nóng)用微生物菌劑（即微生物接種劑）的術(shù)語(yǔ)和定義、產(chǎn)品分類、要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、包裝、標(biāo)識(shí)、運(yùn)輸和貯存。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于農(nóng)用微生物菌劑類產(chǎn)品。
2　規(guī)范性引用文件（略）
3　術(shù)語(yǔ)和定義（略）
4　產(chǎn)品分類
產(chǎn)品按劑型可分為液體、粉劑、顆粒型；按內(nèi)含的微生物種類或功能特性可分為根瘤菌菌劑、固氮菌菌劑、解磷類微生物菌劑、硅酸鹽微生物菌劑、光合細(xì)菌菌劑、有機(jī)物料腐熟劑、促生菌劑、菌根菌劑、生物修復(fù)菌劑等。
5　要求
5.1　菌種
生產(chǎn)用的微生物菌種應(yīng)安全、有效。生產(chǎn)者應(yīng)提供菌種的分類鑒定報(bào)告，包括屬及種的學(xué)名、形態(tài)、生理生化特性及鑒定依據(jù)等完整資料。生產(chǎn)者應(yīng)提供菌種安全性評(píng)價(jià)資料。采用生物工程菌，應(yīng)具有允許大面積釋放的生物安全性有關(guān)批文。
5.2　產(chǎn)品外觀（略）
5.3　產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)
5.3.1　農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)見(jiàn)表1，其中有機(jī)物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)按表2執(zhí)行。
表1 農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)

表2 有機(jī)物料腐熟劑產(chǎn)品的技術(shù)指標(biāo)

5.3.2　農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品中無(wú)害化指標(biāo)見(jiàn)表3。
表3 農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品的無(wú)害化技術(shù)指標(biāo)

6　試驗(yàn)方法
6.1　儀器設(shè)備（略）
6.2　試劑（略）
6.3　產(chǎn)品參數(shù)的檢測(cè)
6.3.1　外觀(感官)的測(cè)定
取少量樣品放到白色搪瓷盤(或白色塑料調(diào)色板)中，仔細(xì)觀察樣品的顏色、形狀、質(zhì)地。
6.3.2　有效活菌數(shù)的測(cè)定
采用平板計(jì)數(shù)法，根據(jù)所測(cè)微生物的種類選用適宜的培養(yǎng)基。
若采用最大可能數(shù)（Most Probable Number，MPN）5管法，遵照附錄C的規(guī)定。
6.3.2.1　系列稀釋
稱取樣品10 g（精確到0.01 g），加入帶玻璃珠的100 mL的無(wú)菌水中(液體菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無(wú)菌水中)，靜置20 min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即成母液菌懸液（基礎(chǔ)液）。
用無(wú)菌移液管分別吸取5.0mL上述母液菌懸液加入45 mL無(wú)菌水中，按1:10進(jìn)行系列稀釋，分別得到1:1×101，1:1×102，1:1×103，1:1×104……稀釋的菌懸液（每個(gè)稀釋度應(yīng)更換無(wú)菌移液管）。
6.3.2.2　加樣及培養(yǎng)
每個(gè)樣品取3個(gè)連續(xù)適宜的稀釋度，用無(wú)菌移液管分別吸取不同稀釋度菌懸液0.1 mL，加至預(yù)先制備好的固體培養(yǎng)基平板上，分別用無(wú)菌玻璃刮刀將不同稀釋度的菌懸液均勻地涂于瓊脂表面。
每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)以無(wú)菌水作空白對(duì)照，于適宜的條件下培養(yǎng)。
6.3.2.3　菌落識(shí)別
根據(jù)所檢測(cè)菌種的技術(shù)資料，每個(gè)稀釋度取不同類型的代表菌落通過(guò)涂片、染色、鏡檢等技術(shù)手段確認(rèn)有效菌。當(dāng)空白對(duì)照培養(yǎng)皿出現(xiàn)菌落數(shù)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果無(wú)效，應(yīng)重做。
6.3.2.4　菌落計(jì)數(shù)
以出現(xiàn)20~300個(gè)菌落數(shù)的稀釋度的平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（絲狀真菌為10~150個(gè)菌落數(shù)），分別統(tǒng)計(jì)有效活菌數(shù)目和雜菌數(shù)目。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在20～300個(gè)之間時(shí)，則以該平均菌落數(shù)計(jì)算。若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在20～300個(gè)之間時(shí)，應(yīng)按兩者菌落總數(shù)之比值決定。若其比值小于等于2應(yīng)計(jì)算兩者的平均數(shù)；若大于2則以稀釋度小的菌落平均數(shù)計(jì)算。有效活菌數(shù)按式（1）或式（2）計(jì)算：
nm = kv1/(m0v2) ×10-8 …………………（1）
nv = kv1/(v0v2) ×10-8 …………………（2）

式中：
nm — 質(zhì)量有效活菌數(shù)， 億/g
nv — 體積有效活菌數(shù)， 億/mL
— 菌落平均數(shù)， 個(gè)
k — 稀釋倍數(shù)
v1 — 基礎(chǔ)液體積， mL
v2 — 菌懸液加入量， mL
v0 — 樣品量， mL
m0 — 樣品量， g
6.3.3　霉菌雜菌數(shù)的測(cè)定
采用馬丁培養(yǎng)基，測(cè)定方法同6.3.2。
6.3.4　雜菌率的測(cè)定
除樣品有效菌外其它的菌均為雜菌。樣品中雜菌率按式（3）計(jì)算：
m = n1/(n1+n)×100 …………………（3）
式中：
m — 樣品雜菌率， %
n1 — 雜菌數(shù)， 億/g(mL)
n — 有效活菌數(shù)， 億/g(mL)
6.3.5　水分的測(cè)定
將空鋁盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃烘干 0.5 h，冷卻后稱量記錄空鋁盒的質(zhì)量。然后稱取2份平行樣品（顆粒型樣品，應(yīng)先粉碎過(guò)1.0 mm試驗(yàn)篩），每份20 g（精確到0.01 g），分別加入鋁盒中并記錄質(zhì)量。將裝好樣品的鋁盒置于干燥箱中105 ℃±2 ℃下烘干4 h~6 h。取出置于干燥器中冷卻20 min后進(jìn)行稱量。水分含量按式（4）計(jì)算（結(jié)果為兩次測(cè)定的平均值）：
w = (m1- m2)/( m1- m0) ×100 …………………（4）
式中：
w — 樣品水分含量， %
m0 — 空鋁盒的質(zhì)量， g
m1 — 樣品和鋁盒的質(zhì)量， g
m2 — 烘干后樣品和鋁盒的質(zhì)量， g
6.3.6　細(xì)度的測(cè)定
6.3.6.1　粉劑樣品
稱取樣品50 g（精確到0.1 g），放入300 mL燒杯中，加200 mL水浸泡10 min~30 min后倒入孔徑0.18 mm的試驗(yàn)篩中，然后用水沖洗，并用刷子輕輕地刷篩面上的樣品，直至篩下流出清水為止。將試驗(yàn)篩連同篩上樣品放入干燥箱中，在105 ℃±2 ℃烘干4 h ~6 h。冷卻后稱量篩上樣品質(zhì)量。樣品細(xì)度按式（5）計(jì)算：
s ={1- m1/[ m0（1-w）]} ×100 …………………（5）

式中：
s — 篩下樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)， %
m0 — 樣品質(zhì)量， g
w — 樣品含水量， %
m1 — 篩上干樣品質(zhì)量， g
6.3.6.2　顆粒樣品
稱取樣品50 g（精確到0.1 g），將兩個(gè)不同孔徑的試驗(yàn)篩（1.0 mm和4.75 mm）摞在一起放在底盤上(大孔徑試驗(yàn)篩放在上面)。樣品倒入大孔徑試驗(yàn)篩內(nèi)篩樣品，然后稱小孔徑試驗(yàn)篩上的樣品質(zhì)量。顆粒細(xì)度按式（6）計(jì)算：
g = m1 /m0 ×100 …………………（6）
式中：
g — 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)， %
m1 — 小孔徑試驗(yàn)篩上樣品質(zhì)量，g
m0 — 樣 品 質(zhì) 量， g
6.3.7　pH值的測(cè)定
打開(kāi)酸度計(jì)電源預(yù)熱30 min，用標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)。
pH值的測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)三次，計(jì)算三次的平均值。
6.3.7.1　液體樣品
用量筒取40mL樣品放入50 mL的燒杯中，直接用酸度計(jì)測(cè)定，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄。
6.3.7.2　粉劑樣品
稱取樣品15 g，放入50 mL的燒杯中，按1:2(樣品:無(wú)離子水)的比例將無(wú)離子水加到燒杯中(如果樣品含水量低，可根據(jù)基質(zhì)類型按1:3~1:5的比例加無(wú)離子水)，攪拌均勻。然后靜置30 min，測(cè)樣品懸液的pH值，儀器讀數(shù)穩(wěn)定后記錄。
6.3.7.3　顆粒樣品
樣品先研碎過(guò)1.0 mm試驗(yàn)篩，按照6.3.7.2的方法測(cè)定。
6.3.8　糞大腸菌群數(shù)的測(cè)定
應(yīng)符合GB/T 19524.1《肥料中糞大腸菌群的測(cè)定》的規(guī)定。
6.3.9　蛔蟲(chóng)卵死亡率的測(cè)定
應(yīng)符合GB/T 19524.2《肥料中蛔蟲(chóng)卵死亡率的測(cè)定》的規(guī)定。
6.3.10　纖維素酶活、蛋白酶活的測(cè)定
應(yīng)符合附錄D的規(guī)定。
6.3.11　砷、鎘、鉛、鉻、汞的測(cè)定
應(yīng)符合GB 18877—2002中的5.12~5.17的規(guī)定。
6.3.12　保質(zhì)期的檢驗(yàn)
在產(chǎn)品說(shuō)明書標(biāo)明的保質(zhì)期前，按6.3.1~6.3.11方法測(cè)定產(chǎn)品相應(yīng)指標(biāo)。
7　檢驗(yàn)規(guī)則
本標(biāo)準(zhǔn)中產(chǎn)品技術(shù)指標(biāo)的數(shù)字修約應(yīng)符合GB 8170的規(guī)定；產(chǎn)品質(zhì)量合格判定應(yīng)符合GB 1250中修約值比較法的規(guī)定。
7.1　抽樣
按每一發(fā)酵罐菌液（或每批固體發(fā)酵）加工成的產(chǎn)品為一批，進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，抽樣過(guò)程嚴(yán)格避免雜菌污染。

7.1.1　抽樣工具
無(wú)菌塑料袋(瓶)，金屬勺、抽樣器、量筒、牛皮紙袋、膠水、抽樣封條及抽樣單等。
7.1.2　抽樣方法和數(shù)量
一般在成品庫(kù)中抽樣，采用隨機(jī)法抽取。
抽樣以件為單位，小包裝以每一包裝箱為一件。隨機(jī)抽取3~5件，每件中隨機(jī)抽取一袋(瓶)；若每袋(瓶)包裝小于500 g（mL）的產(chǎn)品，應(yīng)多抽幾件。大包裝產(chǎn)品以一袋(桶)為一件，隨機(jī)抽取5~10件，在無(wú)菌條件下，每件取樣500 g(mL)，然后將抽取樣品混勻，按四分法分裝3袋(瓶)，每袋（瓶）不少于500 g(mL)。
7.2　檢驗(yàn)分類（略）
7.3　判定規(guī)則
7.3.1　具下列任何一條款者，均為合格產(chǎn)品
a. 檢驗(yàn)結(jié)果各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)要求的產(chǎn)品；
b. 在產(chǎn)品的外觀、水分、細(xì)度、pH值等檢測(cè)項(xiàng)目中，有1項(xiàng)不符合要求，而其它各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)符合要求的產(chǎn)品。
7.3.2　具下列任何一條款者，均為不合格產(chǎn)品
a. 有效活菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)；
b. 霉菌雜菌數(shù)不符合技術(shù)指標(biāo)；
c. 雜菌率不符合技術(shù)指標(biāo)；
d. 糞大腸菌群不符合技術(shù)指標(biāo)；
e. 蛔蟲(chóng)卵死亡率不符合技術(shù)指標(biāo)；
f. 砷、鎘、鉛、鉻、汞中任一含量不符合技術(shù)指標(biāo)；
g. 有機(jī)物料腐熟劑產(chǎn)品中所測(cè)酶活不符合技術(shù)指標(biāo)；
h. 在外觀、水分、細(xì)度、pH值等檢測(cè)項(xiàng)目中，有2項(xiàng)（含）以上不符合要求。
8　包裝、標(biāo)識(shí)、運(yùn)輸和貯存
參見(jiàn)NY 885-2004《農(nóng)用微生物產(chǎn)品標(biāo)識(shí)要求》

　

附　錄　A 常用檢測(cè)培養(yǎng)基
　
參見(jiàn)NY/T 1114-2004《微生物肥料實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基技術(shù)條件》

　
附　錄　B
（資料性附錄）
常用染色劑
B.1　革蘭氏染色劑
B.1.1　結(jié)晶紫染色液（Hucker氏配方）
甲液：結(jié)晶紫（Crystal violet） 2.0 g
乙醇(95%) 20.0 mL
乙液：草酸銨[(NH4)2C2O4?H2O] 0.8g
蒸餾水 80.0 mL
甲、乙兩液相混，過(guò)濾，棕色瓶保存。
B.1.2　盧哥(Lugol)氏碘液
碘(I2)片 1.0 g
碘化鉀(KI) 2.0 g
蒸餾水 300 mL
先溶碘化鉀于少量蒸餾水中，再將碘溶于碘化鉀溶液中，可稍加熱，最后加足蒸餾水，棕色瓶保存。
B.1.3　脫色液 95%的乙醇液。
B.1.4　復(fù)染液 0.5%的番紅水溶液（Safranin O)
2.5%的番紅酒精溶液 20 mL
蒸餾水 80 mL
B.2　芽胞染色液
B.2.1　孔雀綠染色液（Malachite green）
孔雀綠 5.0 g
蒸餾水 100 mL
B.2.2　0.5%番紅染色液
B.3　石碳酸復(fù)紅染色液
甲液：堿性復(fù)紅(Basic fuchsin) 0.3 g
95%酒精 10.0 mL
乙液：石碳酸(Phenoecrystals C.P) 5.0 g
蒸餾水 95 mL
將甲、乙兩液混合后即得石碳酸復(fù)紅染色液原液。染色時(shí)，將原液稀釋5~10倍使用。

　
附　錄　C
（規(guī)范性附錄）
稀釋法（MPN 5管法）
C.1　稀釋
稱取樣品10.0 g，加入帶玻璃珠的100 mL的無(wú)菌水中(液體菌劑取l0.0 mL加入90 mL的無(wú)菌水中)，靜置20 min，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min充分振蕩30 min，即得到1×101稀釋度的菌懸液。
用無(wú)菌移液管吸取5.0mL上述菌懸液加入到裝有45mL無(wú)菌水的三角瓶中，充分振蕩搖勻，得到1×102稀釋度的菌懸液，依此方法制成1×103、1×104、1×105……稀釋度的菌懸液（每個(gè)稀釋度應(yīng)更換無(wú)菌移液管）。
C.2　加樣
選擇適宜的5個(gè)連續(xù)稀釋度，用無(wú)菌移液管分別吸取不同稀釋度的菌懸液1.0 mL，加到已準(zhǔn)備好的盛有9.0 mL無(wú)菌培養(yǎng)基的螺口試管中，每一稀釋度重復(fù)接5支試管（不同稀釋度間更換無(wú)菌移液管），同時(shí)用無(wú)菌培養(yǎng)液作對(duì)照。
C.3　培養(yǎng)
接種后立即擰緊塑料帽并搖勻，將接種好的試管放到適宜的條件下培養(yǎng)。
C.4　計(jì)算
根據(jù)各稀釋系列試管中有無(wú)待測(cè)微生物生長(zhǎng)或其生理反應(yīng)的正或負(fù)得出數(shù)量指標(biāo)，并在相應(yīng)的MPN統(tǒng)計(jì)表中查出近似值（見(jiàn)表C1），即可計(jì)算出待測(cè)樣品的有效活菌數(shù)，以億個(gè)/mL或億個(gè)/g表示。
計(jì)算方法：
1mL（g）樣品中的有效活菌數(shù)=菌數(shù)近似值×數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)
C.5　計(jì)數(shù)規(guī)則
在稀釋系列中必須最后一個(gè)稀釋度所有重復(fù)間都沒(méi)有微生物生長(zhǎng)。確定數(shù)量指標(biāo)系取稀釋系列中所有重復(fù)都有生長(zhǎng)(或是正反應(yīng))的最高稀釋度為數(shù)量指標(biāo)的第一位數(shù)字，總共取三個(gè)連續(xù)稀釋管的結(jié)果查表。
C.5.1　在全部5支試管中均出現(xiàn)生長(zhǎng)的稀釋度中，把出現(xiàn)生長(zhǎng)的稀釋度倍數(shù)最高的那一級(jí)放入數(shù)列。例如：為5-5-3-0-0時(shí)，則取5-3-0數(shù)列；
C.5.2　在全部5支試管中均不出現(xiàn)生長(zhǎng)的稀釋度中，把稀釋度倍數(shù)最低的那一級(jí)放入數(shù)列。例如：為5-3-0-0-0時(shí)，則取5-3-0數(shù)列；
C.5.3　如果應(yīng)用上述兩條規(guī)則，會(huì)出現(xiàn)采用如5-5-4-3-0這樣的4個(gè)等級(jí)的稀釋度的情況。此時(shí)，可先取前面的5-4-3數(shù)列，后取4-3-0數(shù)列，分別求出lgMPN，然后算出其真數(shù)的平均值。在此列中，數(shù)列5-4-3的lgMPN為1.447，數(shù)列4-3-0的lgMPN為0.431+1（后一數(shù)列與前一數(shù)列相應(yīng)稀釋了10倍，故要加1進(jìn)行校正），（1.447+1.431）/2=1.439，所以MPN=27.5。

表C.1 MPN，lgMPN表